ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS - FUNDAMENTOS

La electroforesis es el transporte de partículas cargadas en un campo eléctrico. Es una técnica de separación en la que estas partículas se separan mediante la diferencia de su velocidad de migración. La electroforesis se utiliza para separar compuestos con carga neta, como aminoácido, péptidos, proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos.

Figura 1: Migración de partículas en un proceso electroforético. 

Teóricamente en el transporte electroforético a la fuerza del campo (Feléc = q.E) se opone a la resistencia viscosa del medio  (Fres = f.v), lo que produce, cuando se igualan, una velocidad constante de las partículas. El proceso puede describirse así:

Feléc = Fres 

q.E = f.v

Donde:            q = carga eléctrica de la partícula

                       E = valor del campo eléctrico

                       v = velocidad de las partículas

                       f = coeficiente de rozamiento

La movilidad electroforética (u) de una partícula es la velocidad de migración por unidad de campo eléctrico:

u = v/E

De  q.E = f.v  tenemos:

v = q.E/f

y sustituyendo este valor de (v) se obtiene la ecuación:

u = q/f

De esta manera la movilidad electroforética de una molécula depende directamente de su carga y es inversamente prporcional al coeficiente de rozamiento, que a su vez depende directamente del tamaño y la forma de la molécula y la viscosidad del medio. La migración de las partículas depende del pH del medio en que estén, ya que su carga neta depende del pH.

FUNDAMENTOS BÁSICOS

Las proteínas son moléculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de aminoácidos (fundamentalmente los cargados negativamente como el ácido glutámico y el ácido aspártico; como también los cargados positivamente como la lisina, arginina e histidina) y del grado de ionización de éstos al pH considerado.

Figura 2: Aminoácidos esenciales de cargas positivas y negativas.

Al producirse la mezcla de moléculas ionizadas y con una carga eléctrica neta, luego al ser colocadas en un campo eléctrico, estas experimentarán una fuerza de atracción hacia el polo que posea carga opuesta. De esta manera la moléculas cargadas positivamente se dirigirán hacia el cátodo (polo negativos), y las cargadas negativamente hacia el ánodo (polo positivo).   

Punto Isoleléctrico: la carga eléctrica neta de una molécula es la resultante de las cargas de todos los grupos ionizables. Las moléculas cuya carga eléctrica neta es positiva, negativa o cero, según el pH del medio, se denominan anfolitos.El pH al cual su carga eléctrica neta es cero recibe el nombre de punto isoeléctrico (pI). Si el pH del medio es superior al punto isoeléctrico, la carga eléctrica de la molécula será negativa y se moverá hacia el ánodo. Si el pH del medio es inferior al punto isoeléctrico, la carga eléctrica será positiva y se moverá hacia el cátodo.


Difusión: en la teoría la electroforesis se lleva a cabo en un medio inerte. En la práctica la situación es más compleja, ya que los componentes de las muestras se mezclan con los componentes de la disolución en la que se realiza la electroforesis. Para disminuir este efecto, conocido como difusión, la electroforesis se realiza sobre diferentes soportes como el papel, el acetato de celulosa, el gel de almidón, el gel de agarosa y el gel de poliacrilamida.

Figura 3: La difusión en la electroforesis.

Calor: es directamente proporcional a la diferencia de potencial eléctrico utilizada en la electroforesis, y puede desnaturalizar los componentes de la muestra, además de evaporar el disolvente de la disolución tampón que se encuentra en el medio de soporte. Esto provoca el flujo de dicha disolución desde los compartimientos de los electrodos (cátodo y ánodo) hacia el medio de soporte, formándose las llamadas corrientes de convección que alteran la velocidad de migración. Para evitar los efectos del calor, se deben utilizar aparatos con sistemas de refrigeración adecuados.

Electroendósmosis: los medios de soporte electroforéticos en contacto con el agua adquieren cargas negativas debido a la absorción de iones hidroxilo, estas cargas a su vez se rodean de grupos con una carga eléctrica positiva. La diferencia de potencial eléctrico entre ambos grupos se conoce como potencial electrocinético. Al aplicar un campo eléctrico, los grupos con carga negativa, al estar unidos al soporte, no pueden moverse hacia el ánodo y permanecen inmóviles; sin embargo, los grupos con carga positiva que les rodean sí se pueden mover hacia el cátodo. Este flujo de iones hacia el cátodo disminuye la velocidad de migración de los componentes de la muestra que se mueven en sentido contrario (hacia el ánodo). Este fenómeno es conocido como electroendósmosis.